Avdekking av proteinstruktur

Fra NanoWiki

Figur 1: Atomstrukturen til menneskelig hemoglobin, uten bundet oksygen. De gule gruppene representerer de fire heme-gruppene, mens de andre fargene indikerer adskilte aminosyrekjeder.

Strukturen er publisert på www.pdb.org av J. R. Tame og B. Vallone^[1], og er her vist i gratisprogrammet StarBiochem.

Avdekking av proteinstruktur handler om å finne ut hvilken form og oppbygning ulike proteiner har. I løpet av de siste tiårene har det skjedd en rask utvikling i teknologi og metodikk for bestemmelse av proteinstruktur, og disse nyvinningene har gitt avgjørende kunnskap om naturens virkemåte og muligheter. Per i dag er over 52 000 proteiners struktur bestemt og offentliggjort, og i de siste årene har det blitt avdekket mer enn 5 000 nye proteinstrukturer årlig^[2].

Proteiner er biologiske makromolekyler syntetisert fra enkeltmolekyler av aminosyrer^[3]. Syntetiseringen skjer i celleorganeller kalt ribosomer, som igjen veiledes og reguleres av cellekjernens DNA-baserekke. Foldingen av syntetiserte aminosyrekjeder til ferdigdannede tre-dimensjonale proteiner skjer ved et samspill av spontane og enzym-koblede prosesser. Strukturen til proteiner blir gjerne inndelt i primær-, sekundær-, tertiær- og kvartærstruktur. Dette svarer henholdsvis til proteinets aminosyresekvens, repetitive konformasjoner utgjort av proteinets ryggrad, proteinets tre-dimensjonale atomstruktur og individuelle peptidkjeders orientering i forhold til hverandre^[3]. I denne artikkelen fokuseres det på proteiners tertiærstruktur, altså deres tre-dimensjonale atomstruktur, og avdekking av disse. Her vil derfor begrepet proteinstruktur bli brukt synonymt med en tre-dimensjonal atommodell av proteinet.

Figur 2: J. C. Kendrew i aksjon med sin atommodell av myoglobin, det første proteinet til å få avdekket sin tre-dimensjonale atomstruktur. Kendrew vant sammen med M. F. Perutz Nobelprisen i kjemi i 1962 for sine strukturstudier av globulære proteiner.

Kilde: © MRC Laboratory of Molecular Biology

Den første proteinstrukturen ble avdekket i 1958^[4], da J. C. Kendrew og M. F. Perutz hadde funnet strukturen til myoglobin ved hjelp av røntgenkrystallografi. Året etter kunne Perutz publisere strukturen til det enda større proteinet hemoglobin ved hjelp av samme framgangsmåte (Perutz og Kendrew vant i 1962 Nobelprisen i kjemi for dette arbeidet^[5]). Dette ble startskuddet for avdekking av en lang rekke proteinstrukturer funnet ved røntgenkrystallografi. Først i 1980-årene lyktes man i å utvikle en alternativ strukturbestemmelsesmetode for proteiner: nukleær-magnetisk resonans (NMR)^[4]. I dag er også noen proteinstrukturer avdekket ved hjelp av ulike varianter av elektronmikroskopi^[4]. Røntgenkrystallografi og NMR består imidlertid som de mest brukte teknikkene^[2].

Allerede kjente proteinstrukturer - The Protein Data Bank (PDB)

Figur 3: To representasjoner av myoglobin hentet fra The Protein Databank(PDB). Det venstre bildet viser proteintrådene som bånd, mens de mindre molekylene i myoglobinet er vist som kule-pinne-modell. I det høyre bildet vises alle atomene, med heme- gruppen i rødt og et bundet oksygen- molekyl i turkis. ^[6]

The Protein Data Bank (PDB) er en internasjonal databank bygget opp av forskere fra hele verden. Databanken oppdateres kontinuerlig, og inneholder nå strukturelle data for over 52 000 proteiner^[7]. Dataene ligger lagret som x-, y-, z-koordinater og annen relevant informasjon for de ulike atomene i proteinet. Denne informasjonen kan for eksempel være konformasjoner for aminosyrene, eller hvilke molekyler de ulike atomene tilhører hvis strukturen består av flere molekyler. Ved hjelp av et dataprogram kan man dermed kikke nærmere på ulike deler av strukturen man studerer og få en bedre forståelse av denne. Slike programmer kan man laste ned gratis; to eksempler er StarBiochem og Jmol.

Strukturbestemmelsesmetoder

Av proteinstrukturene publisert i The Protein Databank, er om lag 87 % avdekket ved hjelp av røntgenkrystallografi og rundt 13 % av strukturene funnet ved bruk av NMR. Det totale bidraget fra alle andre strukturbestemmelsesmetoder til sammen er under 1 %^[7]. Alternative teknikker til røntgenkrystallografi og NMR er imidlertid ikke uvesentlige, da noen grupper proteiner vanskelig lar seg strukturbestemme verken ved røntgenkrystallografi eller ved NMR. Eksempler på slike er membranproteiner og proteiner av stor størrelse. Da kan lav-temperatur elektronmikroskopi (CryoEM) være et godt alternativ^[4]. Prinsippene for disse mest brukte strukturbestemmelsesmetodene for proteiner er kort gjengitt nedenfor.

Røntgenkrystallografi (X-ray Crystallography)

Når man bruker bølger til å innhente informasjon om fysiske strukturer, må bølgelengden til bølgene være i samme eller mindre størrelsesorden som de fysiske strukturene man ønsker å avdekke^[8]. Dette gjenspeiles både i Abbe-ligningen for en optisk linse^[9], Rayleighs oppløsningskriterie^[9] og Braggs lov for diffraksjon^[8]. Siden avstandene mellom atomer i organiske molekyler vanligvis er mellom 0,1 og 0,2 nm, er det derfor umulig å avdekke atomstrukturen til et protein ved hjelp av synlig lys, som har bølgelengder på mellom 400 og 800 nm^[10]. Røntgenstråler derimot, med bølgelengder på mellom 0,01 og 1 nm^[10], avhengig av hvilket material de kommer fra, er en ideell kandidat i så måte. En konvensjonell laboratorie-strålingskilde (med CuK som material) produserer røntgenstråler med bølgelengde 0,154 nm^[11].

Imidlertid finnes det ingen kjente linser eller fokuseringsmekanismer som kan samle spredte røntgenstråler^[11]. Dermed må man ved røntgenkrystallografi måle de spredte strålene i seg selv. Slike målinger gir opphav til to-dimensjonale diffraksjonsmønstre. En serie av slike to-dimensjonale diffraksjonsmønstre, fotografert i forskjellige vinkler i forhold til prøven, og for forskjellige retninger av prøven i forhold til røntgenstrålekilden, kan settes sammen til et tre-dimensjonalt diffraksjonsmønster. For en gitt prøve fotograferer man ofte flere hundre tusen to-dimensjonale diffraksjonsmønstre for å danne et tre-dimensjonalt diffraksjonsmønster^[11].

Rommet som det tre-dimensjonale diffraksjonsmønsteret utgjør, kalles ofte for reciprocal space. Hvert av de ulike to-dimensjonale diffraksjonsmønstrene sier noe om hvor i prøven ulike typer atomer befinner seg^[12] (en prikks plassering i diffraksjonsmønsteret er relatert til et atoms plassering i prøven, mens størrelsen av prikken er relatert til atomnummer). Dette gir mulighet for å sette opp et matematisk uttrykk for virkelige atom-posisjoner i prøven (ofte kalt real space, som motsetning til reciprocal space), basert på posisjoner i det tre-dimensjonale diffraksjonsmønsteret. Den matematiske operasjonen ved utregning av dette uttrykket kalles Fourier-transformasjon^[12].

For å utføre Fourier-transformasjonen behøver man imidlertid å kjenne fasen til røntgenbølgene i det de treffer intensitetsmålerne. Dette er kjent som fase-problemet^[11]. En løsning på dette problemet, kalt isomorf erstatning, ble gitt av M. Perutz og medarbeidere i 1954^[13], og først da ble avdekking av proteinstrukturer ble mulig. Løsningen går ut på å tilsette prøven tunge atomer som binder seg til spesifikke aminosyrer i proteinet (som kvikksølv, Hg, eller gull, Au), og analysere forskjellen mellom diffraksjonsmønstre med og uten tilsats av tunge atomer. I dag finnes det imidlertid flere ulike løsninger på fase-problemet.

Med denne teknikken er det teoretisk mulig å bestemme atomstrukturen til et protein ved røntgenbestrålning av kun ett enkelt eksemplar av det aktuelle proteinet. Imidlertid er måleinstrumentene som trengs til å registrere intensiteten avhengig av større intensiteter på de diffrakterte bølgene enn det ett enkelt protein vil kunne gi^[11]. Derfor er teknikken avhengig av å benytte proteinkrystaller; et tre-dimensjonalt periodisk mønster utgjort av tusenvis av enkelteksemplarer av proteinet, som gir den samme diffraksjonseffekten som et enkeltprotein ville gitt, bare forsterket^[11]. Å dyrke frem gode proteinkrystaller utgjør den begrensende faktoren i røntgenkrystallografi i dag^[4].

Som den første teknikken for avdekking av proteinstrukturer, er røntgenkrystallografi i dag et modnet fagfelt. Både utstyr for diffraksjonsmålinger og dataprogramvare for analyse av diffraksjonsmålingene er automatisert. Dersom et protein lar seg krystallisere, tar det nå typisk mellom noen uker og ett år å avdekke atomstrukturen^[11].

Fordeler ved røntgenkrystallografi

• Høy oppløsning dersom god krystall (typisk: 2 Å = 0,2 nm)

• Takler store proteiner

• Velutviklet utstyr, programvare og teori

Ulemper ved røntgenkrystallografi

• Krever produksjon av en relativt stor proteinkrystall

• Fungerer ikke for membranproteiner

• Ingen følsomhet overfor proteiners bevegelighet eller forskjellige konformasjoner

Nukleær-magnetisk resonnans (NMR)

Nukleær-magnetisk resonnans (NMR), eller kjernemagnetisk resonans, bygger på mye av det samme prinsippet som benyttes i en MR-undersøkelse.

Atomkjerner som har egenskapen spinn, har også et magnetisk moment^[14]. Hvis en atomkjerne med et magnetisk moment utsettes for et magnetfelt B, vil momentet rotere rundt retningen til magnetfeltets vertikalakse. Det magnetiske momentet vil da rotere med en bestemt frekvens ω₀, Larmor-frekvensen. Denne rotasjonsbevegelsen kalles presesjon. Larmor-frekvensen avhenger av styrken på magnetfeltet og det magnetiske momentet, og er gitt ved^[15]:

ω₀ = γB₀

der B er den magnetiske feltstyrken og γ er magnetogyrisk ratio, som sier noe om hvor sterk magnetkjernen er.

Dannelse av NMR-spekter

Under et NMR-forsøk utsettes en kjerne for et magnetfelt og radiobølgestråling lik Larmorfrekvensen til kjernen. Hvis et magnetisk moment preseserer med samme frekvens som radiobølgene, vil det magnetiske momentet absorbere energi og endre energitilstand, slik at det dannes kjernemagnetisk resonans. Deretter fjernes strålingen og kjernen vil returnere til den opprinnelige energitilstanden. I denne prosessen emitteres det energi. NMR-spekteret dannes på grunnlag av målinger av den emitterte energien og frekvensene hvor dette skjer.

Hva kan man lese ut ifra et NMR-spekter?

Ulike atomer i et molekyl resonerer med ulike frekvenser ved en gitt feltstyrke. I tillegg vil en variasjon i elektrondistribusjonen rundt et atom gi en variasjon i kjernens magnetiske resonans frekvens. Dette er fordi elektroner skjermer kjernen og dermed endrer det magnetiske feltet rundt atomkjernen. Atomer vil altså resonere med ulik frekvens avhengig av det kjemiske miljøet rundt atomet. Denne variasjonen i resonansfrekvenser for en bestemte atomkjerne forårsaket av ulike elektrondistribusjoner kalles kjemisk shift. En kan dermed få informasjon om en kjernes omgivelser type kjerner som omgir denne kjernen.

Kjemisk skift blir gitt som et relativt mål i forhold til en referanse resonans frekvens. Forskjellen mellom frekvensen til signalet og referansesignalet deles på frekvensen til referansesignal for å gi kjemisk skift .

Fordeler ved NMR

• En behøver ikke lage krystaller

• Kan produsere høyoppløselige bilder av delvis eller helt ufoldede proteiner som mangler en karakteristisk 3D-struktur

Ulemper ved NMR

• Metoden er begrenset til små proteiner

• Fungerer ikke for membranproteiner

• Hvis en kjerne ikke har spinn, vil den ikke skape et magnetisk moment. Dette gjelder for kjerner med både partall antall nøytroner og protoner, for eksempel karbon-12, som er den vanligste isotopene for karbon. Karbon-13 har derimot et spinn som dermed kan brukes til å merke proteinet. Merkingen kan for eksempel gjøres ved produksjon av proteinet i et vekstmedium med mye karbon-13.

Lav-temperatur elektronmikroskopi (CryoEM)

For proteiner eller proteinkomplekser som overskrider størrelsesbegrensningen for NMR, og som samtidig vanskelig lar seg krystallisere til bruk i røntgenkrystallografi, kan det være aktuelt å benytte lav-temperatur elektronmikroskopi (CryoEM)^[4]. Prinsippet for denne metoden er å hurtigfryse proteinene eller proteinkompleksene ved hjelp av flytende nitrogen, slik at vannløsningen inneholdende proteinstrukturen ikke får tid til å danne iskrystall-struktur (som i is og snø). Dermed beholdes også strukturen til proteinet i et (bokstavelig talt) "frosset" bilde av væske-tilstanden. Den fast-frosne protein-prøven seksjoneres så i "to-dimensjonale" segmenter, som deretter analyseres ved hjelp av elektronmikroskopi^[4]. En tre-dimensjonal atommodell bygges så opp ved sammensetting av bilder fra de to-dimensjonale segmentene. Strukturen til virale proteinkapper er blant annet blitt bestemt ved hjelp av denne teknikken^[4]. Strukturen til virale proteinkapper kan man lese mer om her: Virus: Shapes and structure, life cycle.

Lav-temperatur elektronmikroskopi oppnår i seg selv ikke atomær oppløsning. Likevel, i enkelte tilfeller er det mulig å kombinere den lav-oppløselige strukturinformasjonen med atomstrukturer allerede kjent fra røntgenkrystallografi, og slik bygge opp en helhetlig atommodell for store proteiner eller proteinkomplekser som ellers ikke ville kunne blitt modellert^[4].

Relevans for nanoteknologi

De fleste proteiner har en aminosyrelengde på mellom 40 og 4 000^[16] (ekstreme unntak som titin har riktignok over 34 000). Dette betyr at de aller fleste proteiner befinner seg på nanometer-skala i to eller tre dimensjoner. Både kunnskap om proteiners atomstruktur i seg selv samt teknologien utviklet for avdekking av disse, har således, foruten å gi generell innsikt i biologiske nanometer-skala-systemer, muliggjort mange applikasjoner innen nanoteknologi. Et lite utvalg av slike er nevnt nedenfor.

Proteinstrukturer som byggeblokker

Kjente proteinstrukturer utgjør et bibliotek av biokompatible, selv-sammenstillende og lett tilgjengelige nanostrukturer, med egenskaper perfeksjonert av evolusjon^[17]. Dette gjør kjente proteinstrukturer til ideelle potensielle byggeblokker for blant annet bærere av antiviral medisin, plattformer for vevsreparasjon og spektroskopiske biomarkører^[17]. Ved å introdusere syntetiske aminosyrer i peptid-kjeden kan man modifisere naturlig forekommende proteinstrukturer til å få ønsket geometri og størrelse samt ønskede interaksjonsegenskaper^[17]. For eksempel har surfaktant-lignende proteinstrukturer blitt modifisert til å danne nanotuber og nanovaire, mens proteinet i proteinkappen til HIV1-viruset er blitt modifisert til å danne både tubulære, koniske og sfæriske strukturer^[17].

Legemiddel-design

Avdekking av strukturen til proteiner som inngår i sykdomsforløp kan gi hint til hvordan et legemiddel mot sykdommen bør utformes. For bekjempelse av malaria er for eksempel strukturen til proteinet PfHsp90 (Plasmodium falciparum Heat Shock Protein 90) bestemt for å finne fram til en mulig inhibitor^[18]. I andre tilfeller er det interessant å avdekke strukturen til proteiner man allerede vet har terapautiske egenskaper. Dette kan gi informasjon om den terapautiske mekanismen, noe som igjen kan gi grunnlag for modifisering av proteinet eller framstilling av analoge strukturer med lignende virkemåte. En slik framgangsmåte ble brukt av Richard Pauptit et al. ved Zeneca Pharmaceuticals i 1998, der proteinene ricin og carboxypeptidase G2 ble strukturbestemt ved røntgenkrystallografi for å videreutvikle disses effektivitet ved bruk i kreft-terapi^[19].

Protein-nanomaterial-interaksjon

Det har i nyere tid vært en økende interesse for koblinger mellom biologiske molekyler og nanomaterialer, og i forståelse, kontrollering og benytting av biomolekyl-nanomaterial-interaksjoner^[20]. Proteinstrukturer bundet til nanomaterialer kan eksempelvis adressere nanomaterialer til bestemte celler eller fungere som biologiske sensorer for nanoinstrumenter^[20]. Det forskes også på å benytte proteinstrukturers katalytiske egenskaper i byggeprosessen av nanomaterialer^[20].

Kilder

1. ↑ PDB ID: 1A3N. Tame JR, Vallone B. "The structures of deoxy human haemoglobin and the mutant Hb Tyralpha42His at 120 K". Acta Crystallogr. Sect.D 56: 805-811 (2000).
2. ↑ ^{2,0 2,1} http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=general_information/pdb_statistics/index.html&
3. ↑ ^{3,0 3,1} Bruice PY (2006). Essential Organic Chemistry. Pearson Education Inc. pp. 448-456.
4. ↑ ^{4,0 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8} Lesk AM (2004). Introduction to Protein Science. Oxford University Press. pp. 93-99.
5. ↑ http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1962/index.html
6. ↑ PDB ID: 1MBO. Phillips, S.E. "Structure and refinement of oxymyoglobin at 1.6 A resolution". J.Mol.Biol. 142: 531-554 (1980).
7. ↑ ^{7,0 7,1} http://www.pdb.org/pdb/statistics/holdings.do
8. ↑ ^{8,0 8,1} Brandon D, Kaplan WD (2008). Microstructural Characterization of Materials 2nd Edition. John Wiley & Sons. pp. 55-60.
9. ↑ ^{9,0 9,1} Brandon D, Kaplan WD (2008). Microstructural Characterization of Materials 2nd Edition. John Wiley & Sons. pp. 125-134.
10. ↑ ^{10,0 10,1} Mansfield M, O´Sullivan C (2007). Understanding Physics. John Wiley & Sons. p. 550.
11. ↑ ^{11,0 11,1 11,2 11,3 11,4 11,5 11,6} McPherson A (2003). Introduction to Macromolecular Crystallography. John Wiley & Sons. pp. 1-24.
12. ↑ ^{12,0 12,1} McPherson A (2003). Introduction to Macromolecular Crystallography. John Wiley & Sons. pp. 81-117.
13. ↑ McPherson A (2003). Introduction to Macromolecular Crystallography. John Wiley & Sons. pp. 151-178.
14. ↑ Mansfield M, O´Sullivan C (2007). Understanding Physics. John Wiley & Sons. p. 665.
15. ↑ J. C. Edwards. "Principles of NMR"
16. ↑ Bruice PY (2006). Essential Organic Chemistry. Pearson Education Inc. p. 435.
17. ↑ ^{17,0 17,1 17,2 17,3} Zheng J et al. (2007). "Nanostructure Design Using Protein Building Blocks Enhanced by Conformationally Constrained Synthetic Residues". Biochemistry 46: 1205-1218.
18. ↑ Kumar R et al. (2007). "Three-dimensional Structure of Heat Shock Protein 90 from Plasmodium falciparum: Molecular Modelling Approach to Rational Drug Design Against Malaria". J. Biosci. 32: 531-536.
19. ↑ Pauptit et al. (1998). "Immunoconjugates as Anti-Cancer Agents". P.W. Codding (ed.), Structure-Based Drug Design 125-139.
20. ↑ ^{20,0 20,1 20,2} Kane RS, Stroock AD (2007). "Nanobiotechnology: Protein-Nanomaterial Interactions". Biotechnol. Prog. 23: 316-319.